Методы выделения чистых культур микроорганизмов аэробов. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Основные этапы развития микробиологии, вирусологии и иммунологии
К ним можно отнести следующие:
1.Эмпирических знаний (до изобретения микроскопов и их применения для изучения микромира).
Дж.Фракасторо (1546г.) предположил живую природу агентов инфекционных заболеваний- contagiumvivum.
2.Морфологический период занял около двухсот лет.
Антони ван Левенгук в 1675г. впервые описал простейших, в 1683г.- основные формы бактерий. Несовершенство приборов (максимальное увеличение микроскопов X300) и методов изучения микромира не способствовало быстрому накоплению научных знаний о микроорганизмах.
3.Физиологический период (с 1875г.)- эпоха Л.Пастера и Р.Коха.
Л.Пастер- изучение микробиологических основ процессов брожения и гниения, развитие промышленной микробиологии, выяснение роли микроорганизмов в кругообороте веществ в природе, открытие анаэробных микроорганизмов, разработка принциповасептики, методовстерилизации, ослабления (аттенуации) вирулентности и получениявакцин (вакцинных штаммов).
Р.Кох- метод выделения чистых культур на твердых питательных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями, открытие возбудителей сибирской язвы, холеры (запятой Коха ), туберкулеза (палочки Коха), совершенствованиетехники микроскопии. Экспериментальное обоснование критериев Хенле, известные как постулаты (триада) Хенле- Коха.
4.Иммунологический период.
И.И.Мечников- “поэт микробиологии” по образному определению Эмиля Ру. Он создал новую эпоху в микробиологии - учение о невосприимчивости (иммунитете), разработав теорию фагоцитоза и обосновав клеточную теорию иммунитета.
Одновременно накапливались данные о выработке в организме антител против бактерий и ихтоксинов, позволившие П.Эрлиху разработать гуморальную теорию иммунитета. В последующей многолетней и плодотворной дискуссии между сторонниками фагоцитарной и гуморальной теорий были раскрыты многие механизмы иммунитета и родилась наукаиммунология .
В дальнейшем было установлено, что наследственный и приобретенный иммунитет зависит от согласованной деятельности пяти основных систем: макрофагов, комплемента, Т- и В- лимфоцитов, интерферонов, главной системы гистосовместимости, обеспечивающих различные формы иммунного ответа. И.И.Мечникову и П.Эрлиху в 1908г. была присуждена Нобелевская премия.
12 февраля 1892г. на заседании Российской академии наук Д.И.Ивановский сообщил, что возбудителем мозаичной болезни табака является фильтрующийся вирус. Эту дату можно считать днем рождения вирусологии , а Д.И.Ивановского- ее основоположником. Впоследствии оказалось, что вирусы вызывают заболевания не только растений, но и человека, животных и даже бактерий. Однако только после установления природы гена и генетического кода вирусы были отнесены к живой природе.
5. Следующим важным этапом в развитии микробиологии стало открытие антибиотиков . В 1929г. А.Флеминг открыл пенициллин и началась эра антибиотикотерапии, приведшая к революционному прогрессу медицины. В дальнейшем выяснилось, что микробы приспосабливаются к антибиотикам, а изучение механизмов лекарственной устойчивости привело к открытию второго-внехромосомного (плазмидного) генома бактерий.
Изучение плазмид показало, что они представляют собой еще более просто устроенные организмы, чем вирусы, и в отличии отбактериофагов не вредят бактериям, а наделяют их дополнительными биологическими свойствами. Открытие плазмид существенно дополнило представления о формах существования жизни и возможных путях ее эволюции.
6. Современный молекулярно- генетический этап развития микробиологии, вирусологии и иммунологии начался во второй половине 20 века в связи с достижениями генетики и молекулярной биологии, созданием электронного микроскопа.
В опытах на бактериях была доказана роль ДНК в передаче наследственных признаков. Использование бактерий, вирусов, а затем и плазмид в качестве объектов молекулярно- биологических и генетических исследований привело к более глубокому пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе жизни. Выяснение принципов кодирования генетической информации в ДНК бактерий и установление универсальности генетического кода позволило лучше понимать молекулярно- генетические закономерности, свойственные более высоко организованным организмам.
Расшифровка генома кишечной палочки сделало возможным конструирование и пересадку генов. К настоящему времени генная инженерия создала новые направлениябиотехнологии .
Расшифрованы молекулярно- генетическая организация многих вирусов и механизмы их взаимодействия с клетками, установлены способность вирусной ДНК встраиваться в геном чувствительной клетки и основные механизмы вирусного канцерогенеза.
Подлинную революцию претерпела иммунология, далеко вышедшая за рамки инфекционной иммунологии и ставшая одной из наиболее важных фундаментальных медико- биологических дисциплин. К настоящему времени иммунология- это наука, изучающая не только защиту от инфекций. В современном понимании иммунология- это наука, изучающая механизмы самозащиты организма от всего генетически чужеродного, поддержании структурной и функциональной целостности организма.
Иммунология в настоящее время включает ряд специализированных направлений, среди которых, наряду с инфекционной иммунологией, к наиболее значимым относятся иммуногенетика, иммуноморфология, трансплантационная иммунология, иммунопатология, иммуногематология, онкоиммунология, иммунология онтогенеза, вакцинология и прикладная иммунодиагностика.
Микробиология и вирусология как фундаментальные биологические науки также включают ряд самостоятельных научных дисциплин со своими целями и задачами: общую, техническую (промышленную), сельскохозяйственную, ветеринарную и имеющую наибольшее значение для человечествамедицинскую микробиологию и вирусологию.
Медицинская микробиология и вирусология изучает возбудителей инфекционных болезней человека (их морфологию, физиологию, экологию, биологические и генетические характеристики), разрабатывает методы их культивирования и идентификации, специфические методы их диагностики, лечения и профилактики.
22. Методы выделения чистых культур аэробов.
Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.
Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.
Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.
23. Методы выделения чистых культур анаэробов.
Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными
Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные среды (тиогликолевую, Китта - Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высокий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта - Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.
При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (клостридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных клеток посторонней микрофлоры, которая может присутствовать в исследуемом материале
24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологическая, генетическая.
Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.
25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов .
Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных
продуктов.
Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:
а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;
б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);
в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).
Протеазы -ферменты, разлагающие белки:
а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);
б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;
в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;
г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;
д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.
Ферменты-токсины : Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.
Цитотоксины - ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.
Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.
Ппазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше.
Оксидо-редуктазы:
1. Определение оксидаз . На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).
2. Определение каталазы . Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.
3. Определение дегидраз . О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.
4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.
В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:
Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет(+ -) ---- Интер-
суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду
В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной
микроорганизм.
Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический
(имеет историческое (пластинчатых
значение) разводок) Химический Метод Щукевича
Современные
Посев петлей Посев шпателем
(Метод Дригальского)
Методы выделения чистых культур (схема 11):
1. Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материала по поверхности агара.
а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката
б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри
в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.
г) Посев петлей параллельными штрихами .
2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.
а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим выделить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или возбудителя туберкулеза на морских свинках).
б) Химический
– основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.
в) Физический метод
основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.
г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вульгарного протея, способного давать ползучий рост.
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
1. Методы выделения чистой культуры микроорганизмов
2. Методы культивирования микроорганизмов
Уметь:
1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности
2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук
3. Приготовить препараты из колоний бактерий
4. Микроскопировать колоний
5. Окрашивать по Граму микроорганизмы
ЗАНЯТИЕ 8
ТЕМА. Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре-ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз-ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик-роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:
а) мето-ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;
б) методы, основанные на биологиче-ских свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разде-ления микроорганизмов
Рассев шпателем по Дригальскому . Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап-лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе-реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа-тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про-изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимо-сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма-териале на одной из чашек вырастают отдельные коло-нии, пригодные для выделения чистой культуры микро-организма.
Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).
Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма-териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па-раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен-ные растворы смешанной культуры на поверхность твер-дых сред в чашках.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа-щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при-меняется главным образом для очистки вирусов от бак-терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).
Методы, основанные на биологических свойствах мик-роорганизмов
Создание оптимальных условий для размножения
- Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
- Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2 (кампилобактер, геликобактер).
- Метод обогащения. Исследуемый материал за-севают на элективные питательные среды, способствую-щие росту определенного вида микроорганизмов.
Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Метод Пастера (метод предельных разведений). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.
Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.
Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред. К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.
Метод Коха (метод глубинного посева).
Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.
Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.
С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.
Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.
Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.
Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.
Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой.
На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.
Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).
Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.
Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.
В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).
Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.
При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.
Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.
Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.
После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.
Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.
Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.
Предыдущая567891011121314151617181920Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Выделение чистой культуры бактерий
Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро-ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.
Для выделения чистой культуры используют следующие методы.
1. Метод Дригалъского. При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте-рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.
При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.
2. Метод параллельных штрихов. При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.
Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу-ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.
3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды). При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.
После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль-ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.
Характеристика колоний микроорганизмов.
3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.
4. методы выделения чистых культур бактерий.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.
Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.
М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.
ЗАНЯТИЕ 5
ТЕМА ЗАНЯТИЯ : Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ : Ознакомиться с ферментами бактерий.
Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ :
1. Ознакомиться с ферментами бактерий.
Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.
3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.
4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
Ферменты бактерий
Все биохимические процессы в клетке микро-организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).
Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве-ществом.
Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.
Все ферменты делятся на шесть классов:
1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис-лительно-восстановительные реакции. К ним отно-сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.
Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.
3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.
4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.
К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.
5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.
Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).
Активность ферментов измеряют в международных еди-ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре-вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт-ных условиях.
У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.
Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру-ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне-шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.
Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии . Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.
К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.
Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными . Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре-де.
Например, фермент бета-галактозидаза начинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.
Методы определения ферментативной активности микробов
Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).
Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.
В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).
При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.
Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.
При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.
Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.
Энергетический метаболизм
Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.
У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.
Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.
Процесс происходит без участия кислорода.
Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов .
К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо-лекулярный кислород, дыхание называют аэробным . В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным .
По типу дыхания бактерии классифицируют на че-тыре основные группы:
1. Облигатные (строгие) аэробы растут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту-беркулеза).
Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).
Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).
4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол-ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).
Читайте также:
Выделение чистых культур микроорганизмов
Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.
Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.
Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.
Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.
Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.
4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.
Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.
Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.
Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.
Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.
Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.
Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.
Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора . Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».
В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.
Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.
Предыдущая17181920212223242526272829303132Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Методы выделения чистых культур аэробных бактерий
а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката
б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри
в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.
г) Посев петлей параллельными штрихами .
Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.
а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.
В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы-делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз-будителя туберкулеза на морских свинках).
б) Химический
– основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.
Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.
в) Физический метод
основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.
г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль-гарного протея, способного давать ползучий рост.
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.
Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.
При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
Методы выделения чистой культуры микроорганизмов
2. Методы культивирования микроорганизмов
Уметь:
1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности
Обеззараживать материал, проводить обработку рук
3. Приготовить препараты из колоний бактерий
4. Микроскопировать колоний
5. Окрашивать по Граму микроорганизмы
ЗАНЯТИЕ 8
ТЕМА.
Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.
Введение в практику анилиновых красителей
Использование в микроскопии иммерсионной системы и конденсора
Разработка метода культивирования на биологических жидкостях и плотных питательных средах
Разработка метода дробных пересевов
Открытие возбудителя сибирской язвы, холеры, туберкулеза и туберкулина
Примерно в те же годы сформировалась и успешно работала немецкая школа микробиологов во главе с РОБЕРТОМ КОХОМ (1843 - 1910). Кох начал свои исследования в то время, когда роль микроорганизмов в этиологии инфекционных заболеваний подвергалась серьезным сомнениям. Для ее доказательства требовались четкие критерии, которые были сформулированы Кохом и вошли в историю под названием «триады Генле - Коха». Суть триады заключалась в следующем:
1) предполагаемый микроб-возбудитель всегда должен обнаруживаться только при данном заболевании, не выделяться при других болезнях и от здоровых лиц;
2) микроб-возбудитель должен быть выделен в чистой культуре;
3) чистая культура данного микроба должна вызвать у экспериментальных зараженных животных заболевание с клинической и патологической картиной, аналогичной заболеванию человека.
Практика показала, что все три пункта имеют относительное значение, поскольку далеко не всегда удается выделить возбудителя болезни в чистой культуре и вызвать у подопытных животных заболевание, свойственное человеку. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы были найдены у здоровых людей, особенно после перенесенного заболевания. Тем не менее на ранних этапах развития и формирования медицинской микробиологии, когда из организма больных выделяли многих микроорганизмов, не имеющих отношения к данной болезни, триада сыграла важную роль для установления истинного возбудителя заболевания. Исходя из своей концепции, Кох оканчательно доказал, что ранее обнаруженный у животных, больных сибирской язвой, микроорганизм отвечает требованиям триады и является истинным возбудителем данного заболевания. Попутно Кох установил способность сибиреязвенных бактерий образовывать споры.
Велика роль Коха в разработке основных методов изучения микроорганизмов. Так, он ввел в микробиологическую практику метод выделения чистых культур бактерий на твердых питательных средах, впервые использовал анилиновые красители для окраски микробных клеток и применил для их микроскопического изучения иммерсионные объективы и микрофотографирование.
В 1882 г. Кох доказал, что выделенный им микроорганизм является возбудителем туберкулеза, который был впоследствии назван палочкой Коха. В 1883 г. Кох с сотрудниками выделил возбудителя холеры - холерный вибрион (вибрион Коха).
С 1886 г. Кох полностью посвящает свои исследования поискам средств, эффективных для лечения или профилактики туберкулеза. В ходе этих исследований им был получен первый противотуберкулезный препарат - туберкулин, представляющий собой вытяжку из культуры туберкулезных бактерий. Хотя туберкулин не обладает лечебным действием, его с успехом применяют для диагностики туберкулеза.
Научная деятельность Коха получила мировое признание, и в 1905 г. ему была присуждена Нобелевская премия по медицине.
Используя методы, разработанные Кохом, французские и немецкие бактериологи открыли многие бактерии, спирохеты, и простейшие - возбудители инфекционных болезней человека и животных. Среди них возбудители гнойных и раневых инфекций: стафилококки, стрептококки, клостридии анаэробной инфекции, кишечная палочка и возбудители кишечных инфекций (брюшнотифозная и паратифозные бактерии, дизентерийные бактерии Шига), возбудитель кровяной инфекции - спирохета возвратного тифа, возбудители респираторных и многих других инфекций, в том числе вызванных простейшими (плазмодии малярии, дизентирийная амеба, лейшмании). Этот период называют «золотым веком» микробиологии.
Роль отечественных ученых в развитии микробиологической науки (И.И.Мечников, Д.И.Ивановский, Г.Н.Габричевский, С.Н.Виноградский, В.Д.Тимаков, Н.Ф.Гамалея, Л.А.Зильбер, П.Ф.Здродовский, З.В.Ермольева).
Одним из основоположников иммунологии явился И.И.МЕЧНИКОВ (1845-1916) - создатель фагоцитарной, или клеточной, теории иммунитета. В 1888 г. Мечников принял приглашение Пастера и возглавил лабораторию в его институте. Однако Мечниов не порвал тесных связей со своей родиной. Он неоднократно приезжал в Россию, а в его Парижской лаборатории работали многие русские врачи. Среди них Я.Ю.Бардах, В.А.Барыкин, А.М.Безредка, М.В.Вейнберг, Г.Н.Габричевский, В.И.Исаев, Н.Н.Клодницкий, И.Г.Савченко, Л.А.Тарасевич, В.А.Хавкин, Ц.В.Циклинская, Ф.Я.Чистович и другие, которые внесли существенный вклад в развитие отечественной и мировой микробиологии, иммунологии и патологии.
Несмотря на значительные успехи в области создания антиинфекционного иммунитета практически ничего не было известно о механизмах его развития. Поворотным моментом явилось открытие И.И. Мечникова (1845-1916), сделанное им в Мессине в 1882 г. при изучении реакции личинки морской звезды на введение в нее шипа розы. Это был тот счастливый случай, когда случайное наблюдение попало на подготовленный ум и привело И.И. Мечникова к созданию учения о фагоцитозе, воспалении и клеточном иммунитете.
В 1892 г. Мечников опубликовал свой труд «Лекции по сравнительной патологии воспаления», в котором как выдающийся мыслитель рассмотрел патологические процессы с позиций эволюционной теории. В 1901 г. появляется его новая книга «Невосприимчивость к инфекционным болезням», в которой подведены итоги многолетних исследований в области иммунитета.
Большое созидающее значение приобрела дискуссия, развернувшаяся между Мечниковым и его сторонниками с последователями гуморальной теории, видевшими в основе иммунитета действие антител. Начало учению об антителах положили работы П.Эрлиха, а затем Ж.Борде, выполненные в последнее десятилетие XIX в.
Вклад ПАУЛЯ ЭРЛИХА (1854-1915) в развитие иммунологии, так же как в становление и развитие химиотерапии, неоценим. Этот ученый впервые сформулировал понятия об активном и пассивном иммунитете и явился автором всеобъемлющей теории гуморального иммунитета, в котором объяснялось как происхождение антител, так и их взаимодействие с антигенами. Предсказанное Эрлихом существование рецепторов клеток, спецефически взаимодействующих с определенными группами антигенов, в течение многих лет подверглось уничтожающей критике. Однако она была возрождена во второй половине XX столетия в теории Бернета и на молеклярном уровне получила всеобщее признание.
И.И.Мечников одним из первых понял, сто гуморальная и фагоцитарная теории иммунитета не являются взаимоисключающими, а только дополняют друг друга. В 1908 г. Мечникову и Эрлиху совместно была присуждена Нобелевская премия за работы в области иммунологии.
Открытия Эрлиха:
1. использование в практике лечения малярии метиленового синего
2. использование трипанового красного для лечения трипаносома
3. открытие сальварсана (1907 г.)
4. разработка метода определения активности антитоксических сывороток и изучение взаимодействия антиген-антитела
5. теория гуморального иммунитета.
Конец XIX в. ознаменовался эпохальным открытием царства Vira. Первым представителем этого царства явился вирус табачной мозаики, поражающий листья табака, открытый 12 февраля 1892 г. сотрудником кафедры ботаники Петербургского университета Д.И.ИВАНОВСКИМ, вторым - вирус ящура, вызывающий одноименное заболевание у домашних животных, открытый в 1898 г. Ф.Леффлером и П.Фрошем. Однако эти открытия не могли быть в то время по достоинству оценены и остались едва замеченными на фоне блестящих успехов бактериологии.
Главой московской бактериологической школы и одним из лидеров российских бактериологов Г.Н.ГАБРИЧЕВСКИЙ (1860-1907), который в 1895 г. возглавил открытый на частные средства Бактериологический институт при Московском университете. Он работал в области специфического лечения и профилактики скарлатины, возвратного тифа. Его стрептококковая теория происхождения скарлатины в конечном итоге завоевала всеобщее признание. Габричевский является автором «Руководства к клинической бактериологии для врачей и студентов» (1893) и учебника «Медицинская бактериология», который выдержал четыре издания. Г.Н. Габричевский (1860-1907) ввел в России серотерапию, изучал механизмы невосприимчивости к возвратному тифу, дифтерии, скарлатине.
Главным центром Перербургской бактериологической школы стал Институт экспериментальной медицины. Заведующим бактериологическим отделом был утвержден С.Н.ВИНОГРАДСКИЙ, получивший мировую известность своими работами в области общей микробиологии. С помощью разработанного им метода элективных культур. Виноградский открыл серо- и железобактерии, нитрифицирующие бактерии - возбудители процесса нитрификации в почве. Он основал роль микроорганизмов в сельском хозяйстве.
В.Д. ТИМАКОВ (1905-1977) является одним из основателей учения о микоплазмах и L-формах бактерий, занимался генетикой микроорганизмов, бактериофагией, профилактикой инфекционных болезней.
В 1934 году В.Д. Тимакова пригласили в Турменский институт микробиологии и эпидемиологии, где он возглавил отдел по производству вакцин и сывороток. В республике тогда еще высокой была заболеваемость кишечными инфекциями. В.Д. Тимаков защищает кандидатскую диссертацию, посвященную профилактическим препаратам против кишечных инфекций. Свои первые исследования по изучению бактериофагов и фильтрующихся вирусов молодой ученый проводит также в Туркмении.
Под руководством В.Д. Тимакова было начато создание нового раздела медицинской микробиологии – учения об L-формах бактерий и микоплазмах. Это направление явилось логическим продолжением изучения фильтрующихся форм, с которого В.Д. Тимаков начал свою научную деятельность. За цикл исследований по выяснению роли L-форм бактерий и семейства микоплазм в инфекционных заболеваниях В.Д. Тимакову совместно с профессором Г.Я. Каган в 1974 г. была присуждена Ленинская премия.
Одно из основных направлений научной деятельности В.Д. Тимакова посвящено генетике микроорганизмов. В.Д. Тимаков считал необходимым использовать генетические пути анализа для решения медицински значимых микробиологических и эпидемиологических проблем. И в настоящее время направление работ по генетике бактерий является основным в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея. Деятельность В.Д. Тимакова по воссозданию генетики далеко не ограничивалась проведением собственных исследований. Он сделал чрезвычайно много для воссоздания генетики в масштабах всей нашей страны.
Кроме увлеченности делом, Владимиру Дмитриевичу были присущи ясный ум, понимание жизни и смелость. Последнее качество в полной мере проявилось в его борьбе с антинаучными «великими» открытиями, наподобие тех, в которых утверждалось, что вирусы могут превращаться в бактерии.
Выдающийся русский микробиолог Н.Ф.ГАМАЛЕЯ (1859-1949), который еще в 1886 г. работал у Пастера по бешенству, совместно с Мечниковым и Бардахом основал первую в России бактериологическую станцию, где изготавливалась антирабическая вакцина и проводилась вакцинация людей против бешенства. Н.Ф.Гамалея - автор многих научных работ, посвященных бешенству, холере и другим проблемам микробиологии и иммунологии.
Л.А.ЗИЛЬБЕР (1894-1966) является основателем вирусной теории происхождения опухолей, выделил возбудителя дальневосточного клещевого энцефалита.
Успехи в изучении опухолевых антигенов воодушевляют Л.А.Зильбера на попытки противоопухолевой вакцинации, которые он начал около 1950г. вместе с 3.Л.Байдаковой и Р.М.Радзиховской на двух моделях: на опухоли Брауна-Пирс у кроликов и спонтанном раке молочной железы у мышей.
П.Ф. ЗДРОДОВСКИЙ (1890-1976) занимался проблемой риккетси- озов, малярии, бруцеллеза и регуляции иммунитета.
Зинаида Виссарионовна ЕРМОЛЬЕВА - создатель первого отечественного антибиотика. Из всех достижений научно-технического прогресса наибольшее значение для сохранения здоровья людей и увеличения продолжительности их жизни имеет, несомненно, открытие антибиотиков и в первую очередь пенициллина. Среди видных ученых нашей страны, внесших большой вклад в развитие этой области медицины, одно из ведущих мест по праву принадлежит создателю первого отечественного антибиотика, выдающемуся микробиологу, талантливому организатору здравоохранения, известному общественному деятелю, замечательному педагогу, академику АМН СССР, заслуженному деятелю науки РСФСР, лауреату Государственной премии СССР Зинаиде Виссарионовне Ермольевой. Наряду с другими учеными она стояла у истоков медицинской бактериохимии и изучения антибиотиков в нашей стране, была человеком большого организаторского таланта и неиссякаемой энергии, неутомимая деятельность которой и исключительные личные качества снискали ей всеобщее уважение и признание.
Одним из важных направлений научной деятельности Зинаиды Виссарионовны является изучение холеры. На основании глубоких, всесторонних исследований морфологии и биологии холерных и холероподобных вибрионов З. В. Ермольева предложила новый метод дифференциальной диагностики этих микроорганизмов.
В 1942 г. вышла в свет монография З. В. Ермольевой "Холера", в которой подведены итоги почти 20-летнего изучения холерного вибриона. В этой монографии были даны новые методы лабораторной диагностики, лечения и профилактики холеры.
Значительную часть своей научной работы Зинаида Виссарионовна посвятила выделению и изучению веществ, оказывающих антибактериальное действие. Первое такое вещество под названием "лизоцим" было выделено З. В. Ермольевой совместно с И. С. Буяновской еще в 1929 г. Как показали результаты дальнейших исследований, лизоцим встречается во многих тканях, как животного, так и растительного происхождения.
В 1960 г. группа ученых, возглавляемая З. В. Ермольевой, впервые в нашей стране получила противовирусный препарат интерферон. Этот препарат был применен впервые для лечения тяжелой формы гриппа в 1962 г. и как профилактическое средство. Препарат применяется и в настоящее время для профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций, а также для лечения ряда вирусных заболеваний в глазной и кожной практике.
Более 30 лет жизни (1942-1974) Зинаида Виссарионовна посвятила изучению антибиотиков.
Имя З. В. Ермольевой неразрывно связано с созданием первого отечественного пенициллина, становлением науки об антибиотиках, с их широким применением в нашей стране. Большое число раненых в первом периоде Великой Отечественной войны требовало интенсивной разработки и немедленного введения в медицинскую практику высокоэффективных препаратов для борьбы с раневой инфекцией. Именно в это время (1942) З. В. Ермольевой и ее сотрудниками во Всесоюзном институте эпидемиологии и микробиологии был найден активный продуцент пенициллина и выделен первый отечественный пенициллин - крустозин. Уже в 1943 г. лаборатория начала готовить пенициллин для клинических испытаний.
Позже под руководством З. В. Ермольевой были созданы и внедрены в производство многие новые антибиотики и их лекарственные формы, в том числе экмолин, экмоновоциллин, бициллин, стрептомицин, тетрациклин; комбинированные препараты антибиотиков (дипасфен, эрициклин и др.). Следует подчеркнуть, что Зинаида Виссарионовна всегда активно участвовала в организации промышленного производства антибиотиков в нашей стране.
